Năm Gia Tĩnh thứ 45 (1566), Thế Tông hoàng đế băng hà, Dụ vương Chu Tái Hậu lên ngôi, lấy niên hiệu Long Khánh (隆慶), tức Minh Mục Tông. Long Khánh nguyên niên, sách lập Trần thị lên ngôi Hoàng hậu.

Trần hoàng hậu tuy có dung mạo xinh đẹp nhưng không được sủng ái vì bà không có con. Bà mắc nhiều bệnh, bị Minh Mục Tông ghẻ lạnh và đưa vào ở trong biệt cung. Cung nữ Lý thị theo hầu Trần hoàng hậu được Mục Tông sủng hạnh, sinh ra Hoàng tử tử Chu Dực Quân (朱翊鈞). Lý thị được phong làm Quý phi ngay sau đó. Mặc dù chỉ là Đích mẫu, Thái tử vẫn rất hiếu thuận với đích mẫu Trần hoàng hậu, mỗi khi bái yết xong lễ ở Phụng Tiên điện cùng Mục Tông và Lý Quý phi, thì ngay sau đó Thái tử liền đến yết kiến Trần hoàng hậu.